고등학교 전기영동 실험 - godeunghaggyo jeongiyeongdong silheom

1. 실험 원리

① DNA 미니 프렙 : 배양된 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 뽑는 실험으로, 대장균을 대량 배양하고 박테리아 채취 후 용해시켜 플라스미드 DNA를 정제하는 과정을 말한다. 플라스미드란 생장에 필수적인 염색체 DNA에서 분리되어 있는 DNA로 원형이다. 대장균은 그람음성균으로 세포벽이 두껍지 않아서 분해하기 용이하다. 세포벽과 세포막을 분해하고 플라스미드의 DNA를 추출해야 한다.

② DNA 겔 전기영동 : DNA를 추출해서 전류를 흘려주면 당인산 골격 때문에 음전하를 띠는 분자들이 전기적인 힘에 의해 겔 안에서 (+)극으로 이동한다. 같은 크기의 분자들이 하나의 집단을 형성하여 띠 모양을 나타낸다. 작은 분자는 큰 분자에 비해 빠른 속도로 이동하기 때문에 분자들은 겔 상에서 서로 다른 위치에서 띠 모양이 나타난다. 각각의 띠를 이루고 있는 분자들의 크기는 이미 크기를 알고 있는 분자들을 나란하게 전기 영동하여 겔 상에 나타난 띠의 상대적 위치를 비교하여 DNA의 크기를 측정할 수 있다.

③ 원심분리 기계 : 대장균 원심분리 통해 세균의 층을 분리하여 대장균만 바닥에 가라앉힌다. 원심 분리하면 리보솜, 미토콘드리아, 엽록체, 핵 순서로 분리되고 찌꺼기가 튜브의 벽면에 부착된다.

④ 볼텍싱 기계 : 격렬하게 흔들어서 용액을 섞고 세포 하나하나가 뭉치지 않고 돌아다닐 수 있게 한다.

⑤ UV protector : 자외선을 쬐어 자외선 영역의 물질을 볼 수 있게 한다. 주황색 필터는 자외선을 차단하는 역할을 한다.

⑥ silicatube : 이중 튜브 사이에 silica(SiO2)가 있는데 원심분리할 때 필터 역할을 한다.

⑦ 아가로스 겔 : TAE buffer랑 한천을 1%로 섞어서 굳힌 겔로 전기영동할 때 대류를

방지하고 시료를 보호하고 시료성분을 흡착시킨다. 아가로스의 갈락토오스가 결합하여

3차원 다공성 그물 구조를 만들며 아가로스의 농도가 높을수록 겔 속 구멍이 적어져서

전기 영동을 할 때 DNA가 느리게 이동한다.

<아가로스 중합체 구조>

실험 기구	수량	실험 기구	수량	실험 기구	수량
대장균	1mL	DNA loading buffer	7uL	100mL 비커	1개
Sol 1	200uL	TAE buffer	300mL	전기영동장치	1개
Sol 2	180uL	원심분리기	1개	1.5mL 마이크로튜브	1개
Sol 3	275uL	볼텍싱기기	1개	실리카 튜브	1개
PW	700uL	Micropipette(~10, ~200, ~1000	1개	아가로스 겔	1개
Elution Buffer	40uL	피펫팁(~10, ~200, ~1000)	10개	자외선 차단 필터	1개
DW	300mL	비닐장갑	1개	얼음물	1컵

3. 실험 방법

1. 마이크로피펫을 이용해서 대장균 1mL를 microtube에 담아 원심분리기에 1분 돌리고 펠렛을 제외한 액체는 버린다.

2. sol 1 200㎕를 첨가하고 20초 정도 볼텍싱하고 얼음물에 넣어둔다.

3. sol 2 180㎕를 첨가하고 4회 인버팅한다.

4. sol 3 275㎕를 첨가하고 4회 인버팅하여 10분 동안 원심분리기에 돌린다.

5. 전체 용량 655㎕ 중 튜브 속 흰색 물질을 제외한 액체 중 실리카튜브로 최대한 많이(약 630㎕ 정도) 옮기고 원심분리 1분 돌려서 불순물을 튜브 아래로 내린다.

6. 튜브 아래 액체를 버리고 DNA가 남아 있는 부분에 PW 600㎕를 넣고 원심분리기 30초 돌린다.

7. 튜브 아래 액체를 버리고 휴지로 닦고 Elution Buffer 40㎕를 실리카의 중앙에 넣고 원심분리기 1분 돌린다.

8. 튜브 아래 용액에 DNA loading buffer 7㎕를 넣고 섞어준다.

9. 전기영동 장치에 0.5배 희석된 TAE buffer가 한천 젤리에 찰랑거릴 정도로 넣는다.

10. 튜브 안에 용액을 well에 넣고 빨간색에 양극을 연결하고 검정색에 음극을 연결하여 약 30분 후에 결과를 관찰한다.

주의 사항

1. 원심 분리기는 항상 좌우 대칭을 맞춰서 돌리고 이번 실험에서는 항상 13000rpm, 4도로 유지한다.

2. 200㎕ 이하 용액은 20~200㎕짜리 마이크로피펫을 쓰면 더 1000㎕ 피펫보다 정확하다.

3. Elution buffer는 40mL 첨가하는데 1방울이라서 꼭 가운데 실리카 부분에 신중하게 넣어야 한다.

4. well에 시료를 넣을 때 너무 깊숙이 넣지 않도록 주의하고 공기방울이 들어가지 않게 한다.

4. 관찰 및 측정 결과

왼쪽 그림은 시료를 150V로 25분간 전기 영동한 결과이다.

well에서 가까운 곳에 파란색 띠가 나타났으며 먼 쪽에서는 노란색 띠가 보인다.

오른쪽 그림은 UV 프로텍터에 아가로스 겔을 넣어서 관찰한 결과이다.

아가로스 겔 위에 DNA가 노란색 띠 근처에서 관찰되었다.

5. 논의 및 결론

1. 시약에 대한 고찰

① sol 1 : (50mM glucose, 25mM Tris-Cl, 10mM EDTA 200㎕)

1) 포도당은 삼투압을 조절하여 대장균의 물을 밖으로 이동시킨다.

2) Tris-Cl은 pH를 8.0 정도로 유지하는 역할을 한다.

3) EDTA는 금속 양이온 두 개 이상과 배위 결합이 가능하기 때문에 킬레이팅(chelating)을 통해 세포벽에 존재하는 lipidoglycan a 와 Ca2+ 같은 양이온을 제거하여 세포벽 파괴를 용이하게 한다. 또한 DNase의 조효소인 Mg2+를 제거하여 DNase가 기능하기 못하게 하여 DNA를 보호한다.

<Tris-Cl 구조> <EDTA 구조>

② sol 2 : (0.2N NaOH, 1% SDS(계면활성제) 180㎕)

1) SDS는 anionic detergent인데 높은 pH로 세포막을 분해하는 alkaline lysis 방법을 이용하여 DNA와 RNA를 변성시키고 단백질을 제거한다.

2) NaOH는 높은 pH를 유도하여 플라스미드 DNA와 유전체 DNA를 모두 변성시킨다.

③ sol 3 : (5M CH3COOK와 CH3COOH 275㎕)

아세트산과 아세트산칼륨은 pH가 4.8인 용액으로 용액을 중화시켜 염색체를 복구하고 물질들을 응집시킨다. 유전체 DNA는 길이가 긴 선형이기 때문에 응집 과정에서 꼬여서 복구가 불가하다. 플라스미드는 원형이고 짧아서 원래 상태로 복구 가능하다. 아세트산칼륨은 SDS와 결합하여 흰색 침전물을 형성한다.

<아세트산 구조> <아세트산칼륨 구조>

④ PW : (C2H5OH 70% 600㎕)

에탄올이 남아 있는 염들을 씻어내어 플라스미드 DNA의 순도를 높여준다. 에탄올이 DNA를 탈수시켜 DNA와의 친화도를 낮춰서 원심 분리했을 때 실리카 윗부분에 DNA가 남아 있고 튜브 아래쪽으로 분해된 물질들을 내려간다.

<에탄올 구조>

⑤ Elution buffer : (DDW 탈이온증류수 40㎕)

유리 증류기에서 증류수를 재증류한 DDW는 DNA와 친화도가 높아서 원심 분리했을 때 DNA와 함께 실리카 아래 튜브로 나온다.

⑥ DNA loading buffer : (Glucose, Glycerol, xylene cyanol FF, Orange G, EtBr 7㎕)

DNA loading buffer는 주로 6X 라서 elution buffer랑 섞어서 1/6배 희석한다.

1) 글리세롤과 같은 고분자는 용액의 밀도를 높여준다. 순수한 DNA

시료만 사용하면 밀도가 작아서 전기영동할 때 well에 안 들어가고

완충 용액에 퍼질 수 있기 때문이다.

전기영동에서 DNA크기를 비교하기 위해 기준 물질인 마커를 사용한다.

2) Xylene cyanol FF 마커는 파란색이며 4000bp(염기쌍) 를 의미한다.

3) Orange G 마커는 노란색이며 50bp를 의미한다.

Bromophenol blue 500bp를 의미하는 보라색 마커를 사용하는 경우도 있다.

4) EtBr은 DNA를 염색하는 역할을 하는데, EtBr의 평면 구조가 DNA 염기 사이로 끼어드는 성질을 가지고 있으며 결합하였을 때 형광이 크게 증사하여 UV 조사로 254nm의 자외선을 받으면 590nm의 빛을 반사하여 DNA의 위치를 알 수 있다. DNA가 길고 농도가 진할수록 EtBr이 많이 끼어들어가 더 밝게 빛이 난다.

⑦ TAE buffer : (Tris base, 아세트산, EDTA)

1) Tris base는 pH가 11.0이고 아세트산과 섞여서 pH를 8.0으로 유지한다. TAE buffer를 사용할 때 중화열을 최소화하기 위해 0.5배 희석하여 사용한다.

2) EDTA는 DNA의 분해를 막아 보호하고 전기영동을 진행할 때 DNA가 크기 별로 이동할 수 있게 한다.

⑧ 얼음물

세 가지 Sol 이 DNA를 필요 이상으로 변형시키지 않도록 중간중간에 플라스미드를 얼음물에 넣어서 반응을 멈추는 역할을 한다. Sol 2는 5분 이상 방치하면 용해가 더 진행되어 버릴 수 있으니 5분을 넘기지 않도록 주의하고 얼음물에 넣는다.

2. 결과값에 대한 고찰

대장균의 플라스미드가 2900bp 인데 UV protector에서 관찰했을 때 DNA가 4000bp인 파란색 띠와 50bp인 노란색 띠 사이가 아니라 노란색 띠와 거의 일치하게 나타났다. 그 이유는 본 실험에서 제한 효소 처리를 하지 않았기 때문이다. 전기영동을 할 때 2900bp가 나오는 플라스미드는 제한효소 처리를 한 DNA의 결과값이다. 위 실험에서는 제한 효소 처리를 생략하여 초나선 형태의 DNA의 나왔고 DNA의 구조적인 차이 때문에 DNA가 2900bp보다 멀리 이동했으며 노란색 마커 근처에서 관찰되었다.

3. 볼텍싱 안하고 특정 단계에서 인버팅하는 이유

Sol 1을 넣고 볼텍싱 기기를 통해 마이크로튜브를 강하게 흔들어서 대장균이 상층액으로 재부유하는 역할을 했다. Sol 2를 넣고 나서는 볼텍싱을 하지 않고 위아래로 살포시 뒤집는 인버팅을 했다. 그 이유는 Sol2에 세포를 용해시키는 성분들이 들어있어서 볼텍싱 기기로 강하게 흔들어버리면 목표물인 플라스미드 DNA까지 복구되지 못할 정로도 손상될 수 있다. 따라서 볼텍싱하지 않는다.

이 과정에서 볼텍싱을 하면 Sol 3을 첨가했을 때 플라스미드 DNA가 원래 상태로 돌아오지 못하고 원심 분리를 하고 다음 단계로 넘어갈 때 DNA 관찰이 불가능하다.

4. DNA 전기영동시 (+)극으로 이동하는 원리

1) DNA의 당인산 골격이 음전하를 띠기 때문에 수용액 상태에서 전류를 가할 때 DNA가 (+)극으로 이동한다.

2) 양이온과 음이온이 서로 끌어당겨서 DNA의 이동을 돕는다. TAE buffer의 Tris base는 수용액 상태에서 Tris 이온으로 존재한다. 전기장에서 음전하를 띠는 DNA가 양극으로 이동하는 동시에 Tris 양이온이 음극으로 이동한다. 이온이 각 극으로 이동하면서 중간에 서로를 끌어당기고 이동이 촉진된다. 또한 양전하는 수용액 전체에 골고루 분포되어 있어서 (-)극으로 먼저 이동을 마무리하는데 이 때 (+)극이 상대적으로 빈자리가 되어 DNA가 빈 곳을 채워주려고 이동할 수 있다.

TAE buffer는 이온 용량이 작기 때문에 음극과 양극 사이 buffer를 순환시켜 음극에 몰려 있는 Tris 양이온을 전기영동 중간에 양극 쪽으로 순환시켜주면 DNA가 더 빠르게 (+)극으로 이동할 수 있다.

5. 전기 영동에 영향을 주는 요인

1) DNA의 크기 : 크기가 작으면 빠르게 이동하고 크기가 크면 이동에 방해를 받아서 천천히 이동한다.

2) 아가로스의 농도 : 아가로스의 농도가 높을수록 겔 속 구멍이 적어서 DNA가 천천히 이동한다.

3) DNA의 구조 : 꼬인 상태로 가장 응집된 초나선(supercoiled) DNA가 가장 빠르고, 선형(linear) DNA가 다음으로 빠르며, 부피가 가장 큰 원형(open circular) DNA가 가장 느리다.

4) 전압의 크기 : 전압이 클수록 전기영동에서 DNA의 이동속도가 빠르다.

5) Buffer의 이온용량 : 이온용량이 클수록 전기를 연결했을 때 극성을 띠는 물질이 효과적으로 이동할 수 있다.